sterilisasi dan penyiapan media

sterilisasi dan penyiapan media


LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI


STERILISASI DAN PENYIAPAN MEDIA










OLEH :


Nama : retno
Stambuk : F1 D1 05 027
Kelompok : III (Tiga)
Asisten Pembimbing : Dafid Wijaya, S.Si


PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS METEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI
2008

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroorganisme ini terdapat dimana saja, hampir disetiap tempat. Bahkan benda-benda, air minum, makanan kita sehari-hari yang kita anggap sudah steril dan bersih, setelah diteliti lagi ternyata masih banyak terdapat mikroorganisme didalamnya. Keberadaan mikroorganisme ini tentu saja ada yang membahayakan dan ada juga yang tidak.
Dalam proses sterilisasi dikenal beberapa cara atau metode, yaitu dengan menggunakan mendidih yang mendidih dengan uap untuk beberapa menit saja, yang kedua dengan menggunakan autoklav, atau yang ketiga dengan penyaringan atau filtrasi. Dalam proses setrilisasi dan penyiapan media ini, kita harus memperhatikan bebeerap hal, tujuanya adalah agar bahan yang kita siapkan tidak terkontaminasi oleh mikroba yang tidak kita kehendaki.
Sterilisisai dan penyiapan media ini sangat penting dalam sebuah pengamatan mikroba, Karena keberhasilan dalam pengamatan sangat tergantung dari keberhasilan kita mensterilisasi dan persiapan media. Sterilisasi sangat penting karena pada saat inilah kita akan membunuh mikroba kontaminan yang akan menghambat atau mengganggu mikroba yang akan kita amati. Sedangkan persiapan media sangat penting, sebab media yang tidak baik akan menghambat pertumbuhan mikroba yang akan kita amati. Konsentrasi media yang akan kita buat harus kita sesuaikan dengan mikroba yang akan kita tumbuhkan, karena tidak semua mikroba dapat tumbuh dalam medium yang sama. Antara satu mikroba dengan mikroba yang lain tentu saja membutuhkan medium yang berbeda-beda, kalaupun sama mediumnya tapi konsentrasi yang dibutuhkan belum tentu juga sama. Ada beberapa mikroba yang dapat tumbuh dalam satu media dengan konsentrasi media yang sama, oleh karena itu dalam pengamatan ini, kita berusaha untuk menumbuhkan beberapa jenis mikroba dalam media yang sama.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah :
1. Memperkenalkan alat-alat dan bahan yang dibutuhkan untuk memperoleh dan memelihara kultur murni
2. Memperkenalkan konsep sterilisasi
3. Memperkenalkan metode untuk memisahkan mikroba tertentud dari populasi campuranya untuk mendapatkan kultur murni


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (insitu) oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide, etilnoksida atau betaprolakton oleh bermacam-macam larutan kimia. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Irianto, 2006).
Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan yang disterilkan (ketahanan terhjadap panas, bentuk yang disterilkan, padat, cair ataupun gas). Penyelidikan suatu spesies mikroorganisme selalu didasrkan atas sifat biakan murni dari spesies mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, untuk dapat memisahkan kegiatan mikroorganisme yang satu dengan yang lain atau untuk memelihara mikroorganisme secara biakan murni, perlu digunakan alat-alat dan medium yang steril (Muhiddin, 2007).
Tujuan utama proses panas adalah untuk merancang kondisi pemanasan sehingga menghasilkan makanan kaleng yang steril komersial. Berbeda dengan sterilisasi total, dalam sterilisasi komersial masih terdapat beberapa mikroba yang masih dapat tumbuh dan hidup setelah pemberian panas (sterilisasi). Pemberian panas yang tidak mencukupi akan meningkatkan resiko terjadinya kerusakan karena mikroba yang masih ada dan yang hampir mati akan aktif kembali dan tumbuh di dalam produk. Proses pemanasan yang diperlukan untuk sterilisasi makanan kaleng diantaranya tergantung pH produk yang proses produk yang tergolong makanan bersifat asam, yaitu yang memiliki pH kurang dari 4,5 seperti misalnya sebagian besar buah-buahan dan beberapa produk tomat, biasanya disterilkan dengan cara memanaskan coldest point sampai mencapai 200oF (93,3oC) (Winamo,1994:59-60).
Yang mempelopori teknik biakan murni dilakukan Brefeld dengan penelitian tentang cendawan. Ia memperkenalkan cara mengisolasi sel tunggal, juga pembiakan cendawan pada media padat. Dan untuk keperluan untuk ini ia menambahkan gelatin pada cairan biakanya, metodenya untuk biakan murni bagi cendawan sangat mengagumkan tetapi ternyata tidak sesuai bila digunakan untuk bakteri yang lebih kecil. Karena itu, metode lain harus dicari untuk bakteri. Salah satu metode yang mula-mula diusulkan ialah metode pengenceran. Cairan yang berisi campuran bakteri diencerkan deengan medium steril dengan harapan pada akhirnya akan diperoleh pertumbuhan yang berasal dari satu sel (Waluyo, 1982 : 23).
Untuk kebanyakan benda, panas merupakan metode sterilisasi yang paling praktis dan efisien. Walaupun tidak seorangpun mengetahui dengan tepat bagaimana panas membunuh mikroorganisme tertentu. Kita benar-benar tahu bahwa kematian itu terjadi dengan menghentikan satu atau lebih protein penting seperti enzim. Jumlah panas yang diperlukan untuk mematikan mikroorganisme berbeda dari satu organisme keorganisme lain (Wesley, 1993).







BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, 1 Mei 2008 dan pada pukul 10.00 WITA sampai selesai, Bertempat di Laboratorium Lanjutan Biologi Fakultas MIPA Universitas Haluoleo Kendari.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah sebagai berikut :
- Erlemeyer - Tabung reaksi - autoklaf otomatis
- Gelas ukur - Rak tabung reaksi
- Pipet ukur - Kapas
- Gelas piala - Alumunium foil
- Autoklaf manual - Botol ampul
2. Bahan
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah sebagai berikut :
- Aquades - Agar
- Ekstrak daging - Pepton
- Dekstrosa - Kentang
- Asam tartarat - Alat-alat dan bahan medium yang akan disterilkan


C. Prosedur Kerja
a. Autoklaf Manual
1. Mengisi autoklaf dengan air hingga dekat sarang
2. Memasukan bahan-bahan (medium) atau peralatan yang akan disterilkan
3. Membiarkan klep uap terbuka, menyalakan autoklaf
4. Bila dari klep uap terdapat cairan yang menetes, berarti ruang dalam autoklaf telah jenuh dengan uap air. Menutup klep uap tersebut
5. Membiarkan autoklaf menyala hingga tercapai suhu 121C dan tekanan 15 lbs. lalu pertahankan selama 15-20 menit
6. Setelah 15-20 menit pada tekanan uap lbs, mematikan autoklaf, menunggu tekanan menurun selama 5-5-10 menit. Membuka klep berlahan-lahan, mengeluarkan uap hingga tekanan kembali nol.

b. Autoklaf Otomatis
1. Mengisi autoklaf dengan aquades sampai batas yang ditentukan
2. Memeriksa juga tempat buangan air diluar autoklaf, jangan sampai isinya berlebihan atau kurang
3. Memasukan medium dan alat-alat yang akan disterilkan
4. Menutup autoklaf rapat-rapat, memeriksa tombol penutupagar benar pada posisi batas akhir ‘close’
5. Menyalakan autoklaf, mengatur suhu, tekanan dan waktu sterilisasi yang diinginkan. Sterilisasi yang umum adalah 100C tekanan 15 lbs selama 15 menit
6. Menekan tombol star, membiarkan hingga tanda bunyi kedua yang menunjukan bahwa kondisi sterilisasi telah tercapai dan tekanan uap dalam autoklaf telah kembali nol
7. Membuka autoklaf dan mengambil isinya yang telah steril.
c. Penyiapan Medium Kaldu Nutrisi (Nutrient Broth)
1. Dengan menggunakan neraca analitik, kertas timbang atau alumunium foil serta gelas ukur, menyiapkan 0,5 g peptone, 0,3 g ekstrak daging dan 100 ml akuades
2. Melarutkan semua zat bahan medium satu persatu kedalam 75 ml aquades pada erlemeyer 250 ml, mengaduk sambil dipanasi hingga semua melarut
3. Menambahkan dengan sisa aquades hingga volume medium mencapai 100 ml
4. Menuangkan masing-masing 10 ml medium kedalam 10 tabung reaksi bersih, menutup dengan kapas dan alumunium foi, mengikat dengan karet
d. Penyiapan Media Agar Nutrisi (Nutrient Agar)
1. Mengulangi langkah-langkah pembuatan medium kaldu nutrisi cair
2. Medium kaldu nutrisi cair tersebut ditambahkan 1,5 g agar, mengaduk-aduk sambil memanaskan hingga agar benar-benar larut (warna medium menjadi jernih)
3. Menuangkan masing-masing 10 ml medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan, dan 5 ml kedalam tabung reaksi untuk agar miring
4. Medium agar nutrisi siap untuk disterilkan menggunakan autoklaf
e. Penyiapan Medium Agar Kentang
1. Menyiapkan 25 g ketang yang telah bersih dan dipotong-potong dadu, 2 g dekstrosa, 1,5 g agar, 1,4 ml asam tartarat, dan 100 ml aquades
2. Merebus kentang dalam 100 ml aquades selama 2 jam sejak mendidih , volume aquades dijaga supaya tetap
3. Mengambil air rebuasan kentang dengan menyaring potongan-potongan kentangnya dengan menggunakan kain kasa
4. Menambahkan air rebusan kentang dengan dekstrosa dan asam tartarat, mengaduk hingga merata
5. Menambahkan 1,5 g agar, sambil mengaduk dan dipanaskan hingga agar melarut sempurna dan medium berwarna bening
6. Memasukan masing-masing 10 ml medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan, dan 5 ml kedalam tabung untuk agar miring. Menyumbat mulut dengan kapas dan lapisan alumuniun foil, mengikat tabung dengan karet.
7. Medium agar kentang siap untuk disterilkan menggunakan autoklaf

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil pengamatan
Sterilisasi
1. Saat membungkus alat-alat yang akan disterilisasi






2. Semua alat-alat dan bahan disterilisasi di autokaf






Penyiapan media

1. Medium agar-agar yang dipakai dalam pembuatan NA (nutrient agar)






2 Medium kentang yang dipakai untuk membuat PDA (potato Destrosa Agar)







3 Saat pemanasan medium agar dan kentang dengan menggunakan hot plate (sampai mendidih)






4. Saat media NA (Nutrient Agar) dan PDA (Potato Destrosa Agar) telah dipanasi dengan hot plate









B. Pembahasan

Sterilisasi dan penyiapan media adalah salah satu proses yang sangat penting dalam penelitian tentang mikroorganisme. Sebab kedua factor ini adalah kunci utama kesuksesan dal;am tahap pengamatan. Kita ketahui bahwa dialam semesta ini banyak sekali bertebaran mikroorganisme, mereka hampir terdapat disemua tempat. Tidak heran jika kita bisa terkontaminasi dimana saja, meskipun kita menganggap tempat tersebut sudah steril.
Dalam proses praktikum sebelum kita menuju kepersiapan media, maka yang harus kita lakukan lebih dahulu adalah sterilisasi. Sterilisasi ini berlaku dimana saja terutama yang berkaitan dengan kesehatan dan mikroorganisme. Dalam pelaksanaan operasi dalam dunia kedokteran, semua alat yang akan digunakan disterilisasi terlebih dahulu. Tujuanya agar alat-alat tersebut benar-benar steril dan bersih dari mikroorganisme yang membahayakan, terutama bagi pasien yang akan dioperasi.
Sterilisasi yang kita lakukan dalam pengamatan ini ditujukan agar alat-alat tersebut steril dari mikroorganisme lain yang akan menjadi kontaminan bagi mikroba yang akan kita tumbuhkan. Sterilisasi yang kita lakukan adalah sterilisasi panas basah dengan menggunakan autoklav. Sterilisasi ini selain bertujuan untuk menjaga mutu kebersihan dan pengamatan dilaboratorium juga bertujuan untuk menjaga agar mikroba yang akan kita amati adalah benar-benar mikroba yang kita inginkan.
Masalah yang sering kita hadapi dalam laboratorium adalah tingkat kesterilan alat-alat yang akan digunakan, bahkan yang lebih parah lagi adalah alat yang akan digunakan untuk mensterilkan benda-benda tersebut juga malah tidak berfungsi dengan baik. Sehingga dalam hal hal ini akan memacu tingkat kegagalan dalam pengamatan.
Seperti yang telah diekmukakan diatas tadi bahwa sterilisasi yang dipakai pada praktikum ini adalah sterilisasi panas basah, dengan menggunkaan autoklav. Alat-alat yang akan disterilkan dalam autoklaf ini, sebelum dimasukkan kedalam autoklaf maka harus dibungkus dengan kertas, tujuanya adalh agar tekanan yang ditimbulakn tidak sampai memecahkan alat-alat tersebut, sebab yang dimasukkan kedalam hampir semuanya adalah alat-alat yang terbuat dari kaca.
Kita ketahui bahwa autoklav memiliki ruangan yang mampu menahan tekanan diatas 1 atm. Dalam autoklaf inilah berlangsung sterilisasi panas basah. Oleh karena itu, setelah air dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air ini akan mengalir keruang pensteril guna mendesak keluar semua udara didalamnya. Jika seanainya masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan menambah tekanan didalam ruang pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu dalam ruangan tersebut.
Alat-alat dan bahan yang akan kita sterilkan sebaiknya ditempatkan dalam beberapa botol yang lebih kecil daripada dikumpulkan dalam sebuah botol yang lebih besar. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pipa uap dibuka, dan temepratur akan terus menerus naik sampai 1210C. Biasanya autoklaf sudah diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan yang ada 1 atmosfer per 1 cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit dimulai sejak termometer pada autoklav menunjuk 1210C. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan demikian suhu mulai Turun sedikit demi sedikit. Autoklaf tidak boleh dibuja sekonyong-konyong, hal ini ditujukan untuk sterilisasi yang jika menggunakan botol dan botol tersebut berisi bahan, maka tidak boleh dibuka sekonyong-konyong agar isi botol tidak meluap kemana-mana. Sebaiknya kita mennunggu sampai manometer menunjuk angka 0, barulah autoklaf dibuka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit.
Selain sterilisasi panas basah ada juga sterilisasi panas kering. Sterilisasi dengan cara ini adalah dengan menggunkan oven atau dengan pembakaran. Alat-alat yang akan disterilkan ditempatkan dalam oven pada suhu 1600-1800C. Sterilisasi panas kering ini caranya adalah alat-alat yang akan kita gunakan dimasukkan daalm oven, karena tingkat efektifitasnya kurang maka waktu yang dibutuhkan cukup lama yaitu sekitar 1-2 jam. Hal ini disebabkan daya penetrasi panas kering tidak sebaik pada panas basah. Sterilisasi panas kering ini cocok untuk alat gelas atau kaca seperti, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, dan lain-lain. Selain dimasukkan dalam oven, ada juga yang dibakar secara langsung. Tetapi pembakarn secara langsung ini hanya umumnya hanya bisa digunakan pada jarum ose. Tingkat keberhasilan dari pembakaran secara langsung ini biasanya mendekati 100%.
Setelah semua alat-alat disterilisasi dan telah dikeluarkan dari autoclav, maka tahapan selanjutnya adalah penyiapan media. Media yang akan dibuat ada dua jenis yaitu media NA (Nutrient Agar), dan PDA (Potato dextroksi Agar). Perbedaan kedua jenis media ini adalah terletak pada bahan dasarnya. Jika media NA menggunakan ekstrak daging dan agar, maka PDA menggunakan ekstrak kentang. Kedua media ini harus dipanaskan terebih dahulu, selanjutnya disimpan didalam kulkas. Tujuan dari penyimpana ini adalah agar medianya tidak rusak.
Tidak semua mikroba dapat tumbuh dlam kedua media ini, ada beberapa jenis mikroba tertentu yang membutuhkan media lain agar bisa tumbuh dan diamati. Tetapi kedua media ini adalah media standar yang banyak digunakan di laboratorium-laboratotium mikrobiologi.
Keberhasilan dalam pengamatan mikroba ini sangat bergantung pafda bahgaimana kita mensterilakan alat, dan bagaimana komposisi media yang kita buat. Sebab komposisi media juga menentukan tingkat keberhasilan mikroba tersebut tumbuh dalam media. Sehingga kedua hal ini harus benar-benar diperhatikan ketika kita akan membiakkan mikroba didalam laboratorium, sebab jika terkontaminasi sedikit saja, maka kemungkinan gagal akan angat besar.

BAB V
PENUTUP

A. Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Alat dan bahan yang digunakan dalam proses sterilisasi dan penyiapan media adalah autoklaf, di mana autoklaf ini biasa dugunakan untuk sterilisasi panas basah dengan memanfaatkan tekanan atmosfir serta uap air yang ada di dalam autoklaf.
2. Sterilisai ada bermacam-macam caranya, yaitu dengan menggunakan panas (panas kering, panas basah, dan pembakaran langsung), atau dengan pasteurisasi dan filtrasi
3. Media untuk dapat mengamati mikroba ada dapat menggunakan media NA (Nutrient Agar) atau PDA (Potato Dextrose Agar).

B. Saran

Agar penjelasan tentang prosedur kerja dalam praktikum ini dapat lebih secara jelas dan terperinci lagi agar tidak terjadi kesalahan dalam membuat laporan.

DAFTAR PUSTAKA


Lay. B. W. 1994. Analisis Mikrobiologi da Laboraorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta

Muhiddin, 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Biologi FMIPA Universitas Haluoleo. Kendari

Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta

Waluyo. 2005. Mikrobiologi Umum. UMPress. Malang

Wesley & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar jilid I. Erlangga. Jakarta